1. DNA測序樣品用什么溶液溶解比較好？

? ??答：溶解DNA測序樣品時，用滅菌蒸餾水溶解最好。DNA的測序反應也是Taq酶的聚合反應，需要一個最佳的酶反應條件。如果DNA用緩沖液溶解后，在進行了測序反應時，DNA溶液中的緩沖液組份會影響測序反應的體系條件，造成Taq酶的聚合性能下降。有很多客戶在溶解DNA測序樣品時使用TE Buffer。的確，TE Buffer能增加DNA樣品保存期間的穩定性，但TE Buffer對DNA測序反應有影響，根據我們的經驗，我們還是推薦使用滅菌蒸餾水來溶解DNA測序樣品。

2. 提供DNA測序樣品時，提供何種形態的比較好？

? ? 答：我們推薦客戶提供菌體，由我們來提取質粒，這樣DNA樣品比較穩定。如果您要以提供DNA樣品，我們也很歡迎，但一定要注意樣品純度和數量。提供的測序樣品為PCR產物時， 特別需要注意DNA的純度和數量。PCR產物應該進行切膠回收，否則無法得到良好的測序效果。有關DNA測序樣品的詳細情況請嚴格參照“測序模板的要求”部分的說明。

3. 提供的測序樣品為菌體時，以什么形態提供為好？

? ? 答：一般菌體的形態有：平板培養菌、穿刺培養菌，甘油保存菌或新鮮菌液等。我們提倡寄送穿刺培養菌或新鮮菌液。平板培養菌運送特別不方便，我們收到的一些平板培養菌的培養皿在運送過程中常常已經破碎，面目全非，需要用戶重新寄樣。這樣既誤時間，又浪費客戶的樣品。一旦是客戶非常重要的樣品時，其后果更不可設想。而甘油保存菌則容易污染。制作穿刺菌時，可在1.5ml的Tube管中加入瓊脂培養基，把菌體用牙簽穿刺于瓊脂培養基（固體）中，37℃培養一個晚上后便可使用。穿刺培養菌在4℃下可保存數個月，并且不容易污染，便于運送。

4. 與測序引物有關的問題

? ??答：對于通用測序引物，只要正確使用，一般不會有太大問題，測序引物問題主要發生在客戶自己提供的PCR引物上。應該明確的一點是并不是所用的用于PCR的引物都可以用來作測序，以下幾種PCR引物將是不適合用作測序引物的：

? ? ①簡并引物，簡并引物必然要在測序模板上有多個結合位點，直接影響測序結果。

? ? ②隨機引物，如RAPD引物，隨機引物一般都比較短，所用退火溫度低，在測序反應的條件下，不能很好地與模板結合。

? ? ③過長的引物，一般要求測序引物不大于24bp，最長不能超過30bp。過長的引物在測序反應的較低的條件下容易在測序模板上有多個結合位點，導致測序結果背景增高。另外，較長的引物純度也將難以保證。通常用于測序的引物純度要在90%以上，引物純度低時，測序反應的背景將明顯增大，直接影響到測序結果。

? ??④有特殊標記的引物，該情況主要指熒光標記的引物。我們測序反應的四種堿基都是熒光標記的，這樣，熒光標記的引物將產生干擾。另外，其他一些有大的標記基團的引物也最好不要用于測序。引物上大的標記基團將直接影響到DNA?片段的遷移率，導致測序結果峰型不好或錯誤。

? ??⑤不純的引物，測序引物對純度的要求很高，合成的引物中非全長的片段可以造成較強的背景。以一個20bp的測序引物為例，?直接脫鹽純化的話，純度至多在70%左右，也就是說將有30%的引物將作為背景噪音，這必將嚴重影響測序結果。一般經PAGE或OPC法純化的引物基本能達到測序的要求。

5. 怎樣選擇（設計）測序用引物？

? ? 答：測序用引物要求非常嚴格，不同于PCR用引物。PCR用引物一般只要能和模板結合，3’端的幾個堿基能完全配對，即使引物長達80～100多個堿基，只要調整PCR反應條件，也能成功進行PCR反應。?而測序用引物便不一樣了，必須嚴格符合以下要求。本公司的測序用引物全用引物設計軟件Primer設計。在本公司測序時，我們可免費幫助設計測序用引物。

? ? ①長度在15～25個堿基左右，一般選擇20個堿基（根據GC含量作適當調整）。

? ? ②3’端盡量選擇G或C堿基（但不絕對），以增加與模板的結合能力。

? ??③Tm溫度應選擇50℃～70℃左右。

? ? ④GC含量應選擇在50%左右，盡量避開A、T、G、C的連續結構。

? ? ⑤避開引物自身形成發夾結構或引物二聚體結構等復雜結構。

? ??⑥保證引物和模板100%匹配，特別是3’端的幾個堿基一定要100%匹配。同時必須嚴格保證引物和模板之間只能有一個結合位點。

6. PCR片段直接測序和PCR片段經克隆后測序的結果有何區別？

? ? 答：眾所周知，PCR壙增過程中會出現很多錯配現象，但不可能所有的錯配都發生在同一位置。PCR片段直接測序時，其結果是PCR片段眾多分子的混合物的結果。如果在某一個點上出現了幾十次錯配現象，但大多數分子（或許是幾十萬個分子）在這個點上應該還是正確的，在測序時，錯配現象也就是反映不出來了。因此，PCR片段直接測序的結果反映的是PCR用模板最原始的結果。而PCR片段經克隆后測序是測定了某一個分子的DNA序列。在幾十個循環的PCR擴增過程中，很難保證某一個分子的任何點都不發生錯配。因此，PCR片段經克隆后的測序結果，往往存在著一些錯配的序列，和PCR片段直接測序的結果相比有些堿基會有所不同。這種錯配現象的多少取決于PCR擴增時使用的DNA聚合酶的保真性能。要減少PCR擴增過程中的錯配現象，在PCR反應時，請選用保真性能高的DNA聚合酶。

7. 我的基因序列與標準序列為什么有差別？

? ? 答：一段基因序列經擴增后，克隆到載體中進行測序。在兩個層次上可能導致序列發生變化。首先在PCR擴增過程中就可能產生錯誤。將片段克隆到載體中也有可能發生突變。其次，測序的準確率問題。ABI公司承諾其儀器的測序精度在一定范圍內可以達到98.5%以上。由于儀器準確率的限制，在一個較長的序列中發生堿基序列錯誤是難以避免的。在確認克隆無誤的情況下，通過雙向測序可以最大限度減少測序的錯誤。您如果想得到您的最準確的序列，進行雙向測序是很有必要的。只進行簡單的單向測序，我們無法保證所測序列的完全準確性，這是由儀器的精度決定的。

8. 過短的PCR產物為什么不適于直接測序？

? ? 答：首先過短的PCR產物純化困難，一般的PCR產物純化試劑盒都要求PCR產物片段大于150bp，過短的PCR產物純化和準確定量都非常困難。因此我們要求用于測序的PCR產物一般不低于150bp長度。其次，由于測序技術本身的限制，測序反應對環境的干擾比較敏感，模板太短的PCR測序受外界的干擾更大，很容易造成測序失敗。

9. 用測序的方法檢測點突變可靠嗎？

? ??答：有的客戶想用測序的方法檢測點突變體，我們認為該方法可靠性不高。主要有以下兩個原因。首先，我們并不清楚突變的序列與正常的序列的比例是多少。測序反應的信號強度直接與模板的量有關，如果突變的模板所占的比例很少，將直接作為背景噪音了，很難檢測出來。只有當測序反應體系中正常的和突變的模板量比較接近時，才能較可靠地檢測到突變體的存在。其次，在同一位置，不同堿基的信號強度一般是不一樣的。這樣即使突變的模板所占的比較較高時，也不一定能準確檢測到突變的存在。另外，測序儀是設計用來測序正常的堿基序列的，軟件在對掃描的結果進行處理時，會盡量提高主峰而將背景信號盡量壓低，以得到盡可能好的結果。因此，當某處出現雙峰時，測序儀一般會認為信號弱的峰為背景信號，在處理過程中，將弱的峰進一步壓低，這樣根部不立于突變體的檢測。因此認為，用測序的方法檢測突變體的存在不是一個好的方法。