產品信息：

產品儲存：請按產品指示溫度保存各成分

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產品介紹：

本產品利用無縫克隆技術來實現基因的定點突變，可用于單點突變和多點突變質粒的構建。本產品無需除去甲基化模板質粒，無需PCR擴增出整個質粒，并且引物設計更加簡便快速，因此可以更加快速，高效地實現定點突變。

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產品特點：

1.?利用2×Xerox PCR Master Mix擴增片段，縮短擴增時間（2-4 kb/min），提高保真性；

2.?引物設計更加簡單，快速；

3.?省略消化甲基化模板質粒的步驟，更加快速，高效；

4.?無需PCR擴增出整個質粒，減少載體的突變。

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實驗原理：

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實驗步驟：

一、突變位點的引物設計

1.?突變位點引物設計要求 ：

?（1）在每個突變位點處需設計一對引物，且突變位點在重疊區約中部位置。可以先設計正向引物，然后通過反向互補得到反向引物。

（2）引物的長度通常為30-40個堿基，突變位點兩側的堿基數在15-20個左右，GC%含量在40%-60%為最佳。

（3）避免引物末端為重復序列。

2. 引物設計示例：

（1）單點突變引物設計：如圖1

圖1

（2）多點突變引物設計：如圖2

圖2

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二、突變片段的制備

1.?PCR擴增

（1）PCR擴增體系

（2）PCR擴增條件

注意：為了獲得更高保真性的擴增產物，采用高濃度模板和少量PCR循環數組合的擴增方法。

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2.?純化片段

（1）電泳檢測：取10 μl PCR產物，根據片段大小選擇合適濃度的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

（2）如果擴增片段單一，建議用PCR產物純化回收試劑盒純化片段；如果有非特異擴增，建議使用瓊脂糖凝膠純化回收試劑回收片段。

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三、線性化載體的制備

????可以通過酶切或PCR擴增的方法來制備線性化載體，且最好使用空載體質粒進行酶切或PCR擴增。

1.?酶切獲得線性化載體

利用單酶切或雙酶切對空載體進行線性化處理，一般雙酶切比單酶切線性化效果好。載體的完全線性化是無縫連接成功的關鍵。單酶切或雙酶切方式制備的線性化載體無需進行末端脫磷酸化處理。通過電泳方法判定載體線性化是否完全時，一定要用未酶切的質粒做對照一起電泳。酶切完成后建議采用膠回收方法純化線性化載體。?

2.?PCR擴增制備線性化載體

以空載體質粒為模板，設計一對引物用高保真DNA聚合酶（如Xerox）擴增，制備用于重組的線性化載體。為防止殘留環狀載體質粒對克隆陽性率的影響，可以采用膠回收方法或者Dpn I消化結合膠回收的方法純化線性化載體。

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四、突變片段與線性化載體的重組連接

連接體系：

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輕輕混合，50℃反應15 min（2-3個片段，15 min；4個片段以上，60 min），反應完成后，將離心管放在冰上數秒。

連接產物可直接用于轉化或放于-20℃保存。

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五、轉化

1.?從-80℃冰箱中拿出感受態細胞，放于冰上溶解；

2.?取5-10 μl連接產物加入到剛化凍的50?μl或100 μl感受態細胞中，輕輕混勻；

3.?冰上靜置20-30 min；

4.?42℃，熱擊90 sec；

5.?冰上放置2 min；

6.?加入900 μl無抗性的LB液體培養基，200 rpm，37℃，培養60 min；

7.?4000 rpm 離心1 min，棄掉部分上清，保留100-200?μl，用吸頭吹打懸浮菌體，取100?μl菌液涂在相應抗性板上，37℃倒置培養過夜。

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六、陽性克隆鑒定

1.?菌落PCR方法；

2.?限制性酶切分析方法；

3.?DNA測序方法

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常見問題及解決方法：

1.?轉化后沒有克隆或克隆數少

（1）感受態細胞效率降低，請用pUC19檢測一下感受態細胞的效率，確保轉化效率在

10^8?cfu/μg以上。

（2）PCR擴增的突變片段產物進行膠回收純化，確定其條帶的大小和單一性。

2.?轉化后菌落有很多空載體質粒?

這種情況主要是由于線性化載體制備不好造成的。鑒定一下質粒的質量，保證質粒完全酶切。如果內切酶無效也會產生這種現象。

3.?測序沒有信號

（1）檢查送測序的質粒和原始質粒酶切后是否大小完全一致 。

（2）用測序引物對原始質粒測序，驗證測序引物的有效性。

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