影響PCR的因素
PCR法的原理：
循環1：
Step1：再含有引物、dNTP及DNA聚合酶的反應液中雙鏈DNA熱變性（94℃，1min）
Step2：引物和熱變性生成的單鏈DNA退貨（60℃，1min）
Step3：在DNA聚合酶作用下合成互補鏈（72℃，1.5min）
循環2：
擴增的雙鏈再次熱變性生成單鏈DNA（返回step1）
（注）不同DNA片段要達到最高的擴增效率，需要設定不同的反應條件。
影響PCR的主要因素
1、循環參數
擴增參數極大的依賴于模板、引物和熱循環儀的參數。
起始DNA變性
PCR開始時的模板DNA完全變形非常關鍵，因為其可以確保在第一個擴增循環時高效利用模板。當模板GC含量低于或等于50%時，95℃加熱1~3分鐘對起始DNA變性是足夠的，對于GC-rich的模板，該步驟可延長至10分鐘。如需使用更長的起始變性時間或需要更高的變性溫度，可在DNA變形后加入Taq DNA Polymerase，這樣可避免酶活性下降。Pfu DNA Polymerase熱穩定性更好，因此可忍受長時間起始變性過程。
熱啟動PCR：熱啟動PCR使用的Taq DNA Polymerase在室溫下沒有活性，需要95℃起始變性/酶激活過程。
變性
通常情況下，每個循環時94~95℃加熱0.5~2分鐘變性DNA是足夠的。對于GC-rich的DNA模板，該步驟可以延長至3~4分鐘。反應體系中加入10~15%甘油或10%DMSO、5%甲酰胺或者1~1.5M三甲酰胺乙內酯可以增強DNA變性效果。當這些試劑存在時，引物-模板復合物的溶解溫度急劇下降，因此退貨溫度需相應的調整。此外10%DMSO和5%甲酰胺可抑制DNa聚合酶的50%活性，因此使用這些添加劑時需適當的增加酶量。
引物退火
退火溫度應該比最低的引物-模板復合物溶解溫度（Tm）低5℃。退火0.5~2分鐘通常是足夠的。如果擴增出現非特異性PCR產物，需逐步優化退火溫度（每次升溫1~2℃）。當使用添加劑（甘油、DMSO、甲酰胺和三甲胺乙內酯）改變引物-模板復合物融解溫度時，其退火溫度也需相應調整。
遞減PCR：某些實驗PCR時使用的引物在常規循環條件下會產生非特異性擴增。在這種情況下，使用常規PCR的改良方法-遞減PCR來降低非特異性的擴增。再PCR的前幾個循環中，選擇的退火溫度高于引物溶解溫度；然后退火溫度每隔1個或2個循環降低1℃直到達到理想的或實驗設定的退火溫度。在剩下的循環中選擇設定的退火溫度。通過這種方法，目標產物的富集程度高于非特異性產物。
延伸
Taq DNA Polymerase和Pfu DNA Polymerase在70~75℃的DNA合成速率最高。通常情況下，Taq DNA Polymerase擴增2kb產物的延伸條件是72℃ 1分鐘。對于更長的擴增產物，延伸時間需相應地延長（1分鐘/kb）。Pfu DNA Polymerase的合成速率較低，延伸時間估計為2分鐘/kb。
長片段PCR：如需擴增長片段模板（>6kb)，推薦延伸溫度降為68℃，這樣可以避免長時間延伸引起的酶活性損失。
循環數
循環數依賴于PCR反應混合物中的模板DNA用量和PCR產物的預期產量。
當反應混合物中的目標序列低于10個拷貝數時，需擴增40個循環。模板含量較高時通常只需擴增25~35個循環。
最后延伸
最后一個循環結束后，推薦72℃延長孵育PCR混合物5~15分鐘，這樣可補平擴增產物的突出末端。如果將PCR產物克隆入TA載體，最后延伸步驟可延長至30分鐘，確保PCR產物3-dA加尾反應的最高效率。
2、引物設計
要擴增模板DNA，首先要設計兩條寡核苷酸引物，所謂引物，實際上就是兩端與待擴增靶DNA序列互補的寡核苷酸片段，兩引物間距離決定擴增片段的長度，兩引物的5‘端決定擴增產物的兩個5’末端位置。由此課件，引物是決定PCR擴增片段長度、位置和結果的關鍵，引物設計也就更為重要。
影響PCR特異性的因素
通過上述內容可以看出有許多因素可以影響PCR的特異性，在此我們作一歸納，供大家參考：
退火步驟的嚴格性：提高退火溫度可以減少不匹配的雜交，從而提高特異性。
減短退火時間及延伸時間可以減少錯誤引發及錯誤延伸。
引物二聚體是最常見的副產品，降低引物及酶的濃度也可以減少錯誤引發，尤其是引物的二聚化。
改變MgCl2（有時KCL）濃度可以改進特異性，這可能是提高反應嚴格性或者對Taq酶的直接作用。
模板中如果存在次級結構，例如待擴增的片段易自行形成發卡結構時，可在PCR混合物中的4×dNTPs中加入7-脫氮-2‘-脫氧鳥苷-5’-三磷酸（7-deaza-2'-deoxyguanosine-5'-trihosphate)(de7GTP)。用de7GTP與dGTP比例為3:1的混合物（150μmol/1de7GTP+50μmol/L dGTP)代替200μmol/L dGTP,則可阻非特異性產物的生成。