無縫克隆的靈活應用讓其成為構建載體的主流方法。其主要的步驟在于重組引物的設計。

下面我們就簡單聊一下重組引物的設計

重組引物包括重組臂(15-25bp)和特異性序列(18-25bp)，以下圖片僅展示載體上重組臂設計。

1.保留酶切位點與不保留酶切位點

如使用HindIII和BmaHI酶切載體

圖1

2.不在酶切載體位點插入序列，而選擇其他位點插入。

如使用BamHI和EcoRI雙酶切載體，但是片段插入到HindIII和XbaI位點處。

圖2

3.引入其他酶切位點

如使用HindIII和XbaI雙酶切載體，F方向引物引入BglII酶切位點。

引入的酶切位點可以在加到HindIII位點前，也可以在保留HindIII位點的情況下其位點后。在R方向引入酶切位點亦然。

圖3

4.含有ATG的酶切位點

含有ATG的酶切位點注意不要移碼。

如使用NcoI和SpeI雙酶切載體，注意NcoI的ATG位點。

圖4

當然無縫克隆在構建載體時還有很多其它靈活應用，這里只是簡單介紹一下，相信您有更多更好的應用。